УДК 616-092:612.017:616.36-002

Изучение патогенеза иммунодефицитных состояний является одной из важнейших задач иммунологии, так как только на основе знания механизмов, приводящих к различным нарушениям иммунореактивности, возможны совершенствование диагностики и разработка адекватных методов коррекции. Примером вторичного иммунодефицита с недостаточно изученным патогенезом являются вирусные гепатиты, частота заболеваемости которыми до сих пор растет [1, 2]. Вместе с тем оценка иммунного статуса рутинными методами не всегда дает однозначный ответ о выраженности иммунодефицита, что в отдельных случаях приводит к некорректному назначению иммунотропных средств [3].

В последние годы получило развитие новое перспективное направление, позволяющее определить состояние иммуно-реактивности, - исследование мета-болических параметров иммунокомпетентных клеток. Можно считать доказанным, что функциональные проявления лимфоцитов происходят только при соответствующем изменении их метаболизма [4, 5, 6]. Кроме того, дополнительную информацию об исследуемой системе можно получить применяя интегративный подход к анализу данных. С этой точки зрения перспективным является использование самообучающихся нейронных сетей, позволяющих осуществить комплексную оценку всего многообразия уровней изучаемых параметров и их взаимосвязей, выявить скрытые неоднородности в распределении структурных показателей системы [7, 8].

Таким образом, целью исследования явилось срав-нительное изучение информативности иммунологических параметров крови и активности метаболических ферментов лимфоцитов у больных вирусными гепатитами В с помощью нейросетевого классификатора.

Обследовано 59 больных гепатитом В (30 женщин и 29 мужчин) в начальной стадии проявления клинических признаков заболевания. Клинический диагноз ставился на основании патогномоничных признаков заболевания. Для верификации диагноза проводился биохимический и иммуноферментный анализ. В качестве контроля обследовано 74 практически здоровых индивида (40 женщин и 34 мужчины).

Общую фракцию лимфоцитов из венозной крови выделяли по общепринятому методу в градиенте плотности фиколл-верографина с последующей очисткой от прилипающих клеток [9]. Идентификация Т-лимфоцитов проводилась методом Е-розеткообразования (тЕ-РОК) [10]. Число хелперов и супрессоров оценивали с помощью теофиллинового теста (соответственно ТФР Е-РОК и ТФЧ Е-РОК) [11]. Содержание иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле [12].

Затем биолюминесцентным методом осуществляли определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), прямой и обратной реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и Обр. ЛДГ соответственно), прямой и обратной реакции малатдегидрогеназы (МДГ и Обр. МДГ соответственно), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДФГДГ соответственно) и глутатионредуктазы (ГР). Активность оксидоредуктаз выражали в ферментативных единицах (1 Е = 1 мкмоль/мин [14]) на 10⁴ клеток.

Нейросетевой классификатор представляет собой компьютерную программу ("НейроМед", г.Красноярск), способную к самообучению и принятию на его основе необходимых решений [7, 8]. Для этого используется обучающая выборка, состоящая из отдельных примеров, каждый из которых представляет собой набор исследуемых параметров. В нашем случае обучающая выборка была разбита на 2 класса: 1 класс - исследуемые показатели здоровых людей, 2 класс - больные вирусным гепатитом В (ВГВ). Задачей классификатора являлось научиться правильно идентифицировать класс, к которому относится пример, а также при полном обучении вычислить информативность входных параметров. В данной работе использована функция классификатора выделять из обучающей выборки примеры, не вписывающиеся по своим параметрам в заданную классификационную модель, что позволило создать уточненный вариант классификационных выборок.

Величина исследуемых иммунологических параметров крови и активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у здоровых людей и больных ВГВ представлена в табл.1. Обнаружено, что у больных ВГВ снижено процентное содержание лимфоцитов в крови, относительная и абсолютная концентрация ТФЧ Е-РОК, а также повышена концентрация IgM в сыворотке крови. Подобный результат иммунологического анализа показывает первую стадию развития ответа иммунной системы на попадание в организм вируса гепатита В, т.е. у больных ВГВ наблюдается активация гуморального звена при относительно не задействованном клеточном иммунитете. Подобный результат согласуется с клиническим состоянием обследуемых.

Таблица 1

Информативность исследуемых иммунологических показателей крови была изучена с помощью нейросетевого классификатора. Обнаружено, что на представленных параметрах иммунной системы по классификационной модели "здоровые - больные ВГВ" нейросеть обучилась со 100% уверенностью, не исключив ни одного примера из обучающей выборки. Наиболее информативными показателями явились относительное количество ТФЧ Е-РОК, концентрация IgG, абсолютное содержание ТФР Е-РОК. При этом такие параметры иммунной системы, как иммунорегуляторный индекс и концентрация ТФР Е-РОК в абсолютных единицах практически не несут информации для классификации нейросетью здоровых людей и больных ВГВ.

Уровни активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у здоровых людей и больных ВГВ представлены в табл.1. Обнаружено, что в лимфоцитах больных ВГВ снижена активность Г6ФДГ, МДГ, НАДГДГ, Обр. МДГ и ГР, но наблюдается тенденция к статистически достоверному увеличению уровня Г3ФДГ. Исследуемые метаболические ферменты условно можно разделить на оксидоредуктазы, определяющие энергетический обмен в клетках и синтетические процессы [5, 6, 14]. Так, снижение активности НАД-зависимых дегидрогеназ митохондриального компартмента (НАДГДГ и МДГ) в лимфоцитах лиц с ВГВ позволяет констатировать низкий уровень субстратного потока по циклу Кребса. Кроме того, энергетическое состояние митохондрий, страдающее за счет сниженного потока в лимонном цикле, усугубляется низким уровнем ключевой реакции малат-аспартатного шунта - обратной реакции МДГ. Это согласуется с результатами исследования, в котором было обнаружено, что у больных ВГВ в лимфоцитах крови понижена активность сукцинатдегидрогеназы и концентрация АТФ [4]. Одним из путей восполнения субстратной недостаточности энергетических процессов является повышение использования продуктов липидного обмена, в связи с чем, вероятно, и выявляется увеличение активности Г3ФДГ в иммунокомпетентных клетках больных ВГВ.

Особенностью метаболических процессов лимфоцитов у больных ВГВ является снижение активности ключевого фермента пентозофосфатного цикла - Г6ФДГ, что соответственно отражается на пластических процессах, зависящих от уровня НАДФН и рибозо-5-фосфата [14]. В частности, можно предположить, что низкий уровень ГР в лимфоцитах у больных ВГВ является отражением недостаточности Г6ФДГ, так как для реакции восстановления глутатиона необходим постоянный приток НАДФН. При этом доказано, что глутатион играет важную роль в пролиферации лимфоцитов [6].

Информативность метаболических ферментов лимфоцитов также была изучена с помощью нейросетевого классификатора. Обнаружено, что наиболее значимыми показателями модели "здоровые - больные ВГВ" явились уровни активности Обр.ЛДГ, Г3ФДГ, НАДФМДГ и НАДФГДГ. Особенностью данного результата является то, что за исключением уровня Г3ФДГ остальные наиболее информативные параметры статистически не различаются между сравниваемыми группами. Основной вклад в классификационную модель вносят оксидоредуктазы, снабжающие энергетические процессы субстратами: шунтирующие (Г3ФДГ и НАДФМДГ) и вспомогательные (НАДФГДГ). При этом, уровни активности Г6ФДГ и МДГ практически не несут информационной нагрузки. Можно предположить, что задача классификационной модели решается не только на абсолютных значениях ферментативных показателей, но и на их относительных величинах, которые в определенной мере могут выражаться через корреляционные взаимосвязи.

Вместе с тем процесс обучения по классификационной модели "здоровые - больные ВГВ" был закончен только после исключения 8 человек (10,8%) из группы здоровых людей и 12 человек (20,3%) из группы больных. Уровни активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови в группах здоровых людей и больных ВГВ, разделенных нейросетевым классификатором, представлены в табл.2. Обнаружено, что у исключенных лиц из группы здоровых людей по сравнению с оставшимися снижены уровни Г6ФДГ, МДГ, НАДГДГ и Обр. МДГ. Обращает внимание, что выявленные различия между разделенными группами здоровых людей практически полностью соответствуют различиям в исходных группах здоровых лиц и больных ВГВ (табл.1). При этом средние значения ферментативной активности лимфоцитов в группе оставшихся здоровых людей практически не отличаются от общей группы. В то же время сравнение средних величин уровней активности ферментативных показателей лимфоцитов в группах оставшихся здоровых и больных людей позволило выявить и новые статистические различия: увеличение активности НАДФМДГ и снижение уровней НАДФГДГ и Обр.ЛДГ у лиц с ВГВ. Кроме того, в связи с уменьшением выборки оставшихся лиц с патологией и, соответственно, увеличением ошибки при сравнении групп не выявляется статистической достоверности в различии уровней Г3ФДГ лимфоцитов крови. У исключенных нейросетевым классификатором из группы больных ВГВ относительно оставшихся здоровых людей и лиц с патологией обнаружено снижение уровней НАДФМДГ и ГР, повышение активности Обр.ЛДГ. Кроме того, в этой группе относительно оставшихся лиц с ВГВ выявляется увеличение уровня НАДФГДГ и относительно здоровых людей - снижение активности Г6ФДГ и ЛДГ (также как и в общей группе больных).

Таблица 2

При изучении иммунологических показателей в сформированных классификатором группах обнаружено, что у исключенных из группы здоровых людей снижен иммунорегуляторный индекс (0,830,18; 0,1>P>0,05). В группе оставшихся больных обнаружено увеличение сывороточной концентрации IgM (1,690,15 г/л; 0,1>P>0,05), а также снижение концентрации IgG (12,490,86 г/л; P<0,001).

Таким образом, при изучении иммунологических показателей крови у больных ВГВ обнаружена активация гуморального звена при относительно неизмененных параметрах клеточного иммунитета. Исследование метаболизма иммунокомпетентных клеток показало, что снижение реактивности лимфоцитов у лиц с ВГВ определяется тремя основными причинами: во-первых, снижением активности оксидоредуктаз, определяющих интенсивность энергетических реакций в клетках; во-вторых, понижением уровня ключевой реакции пентозофосфатного цикла и, в связи с этим, возможным ингибированием рибозо-5-фосфат- и НАДФН-зависимых пластических процессов; в-третьих, понижением уровня реакции восстановления глутатиона и, соответственно,- пролиферативной активности лимфоцитов. Применение нейросетевого классификатора продемонстрировало, что если по иммунологическим показателям больные ВГВ достаточно однородны и четко отличаются от здоровых людей, то по метаболическим параметрам лимфоцитов обнаружены неоднородности в распределении уровней отдельных ферментов, что приводит к исключению нейросетью отдельных примеров из выборки и формированию новых уточненных групп как среди больных ВГВ, так и здоровых людей. При этом, необходимо особо отметить, что из общей группы здоровых людей исключены лица, значения активности внутриклеточных ферментов которых достаточно близки к аналогичным показателям общей группы больных ВГВ. В то же время деление группы больных ВГВ на оставшихся и исключенных произошло с учетом информативности метаболических параметров в данной классификационной модели. Так как сформированные по метаболическим показателям нейросетью группы имеют также и особенности по иммунологическим параметрам, можно заключить, что информативность уровней активности метаболических ферментов лимфоцитов выше по сравнению с исследованными параметрами иммунной системы, и они более полно характеризуют уровень реактивности лимфоцитов.

1. Беляев Е.Н., Подунова Л.Г., Пургаев Е.И. // Эпидемио-логия и инфекционные болезни.- 1997.- ¦ 2.- С.12-13.
2. Онищенко Г.Г. // Эпидемиология и инфекционные болезни.- 1997.- ¦3.- С.4-13.
3. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Черноусов А.Д. // Иммунология.-1995.- ¦1.- С.4-5.
4. Змызгова А.В. // Тер. архив.- 1992.- ¦ 2.- С.18-20.
5. Calder P.C. // Clin. Nutr.- 1994.- Vol.13, ¦1.- P.2-8.
6. Roth S., Droge W. // Cell.Immunol.- 1994.- Vol.155, ¦ 1.- P.183-194.
7. Гилев С.Е., Горбань А.Н., Миркес Е.М. // Докл. АН СССР.- 1991.- Т.320, ¦ 1.- С.220-223.
8. Горбань А.Н. Обучение нейронных сетей.- М.: СП "ParaGraph", 1990.- 160 с.
9. Хейфец Л.Б., Абалакин В.А. // Лаб. дело.- 1973.- ¦ 10.- С.579-581.
10. Jordal M., Holm G., Wigzell M. // J.Exp. Med.- 1972.- Vol.136.- P.207-213.
11. Limatibul S., Shone A., Dosch H. et al. // Clin. Exp. Immunol.- 1978.- Vol.3.- P.503-513.
12. Mancini G., Herenens I. // Immunochemistry.- 1965.- Vol.2.- P.235-249.
13. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. // Лаб. дело.- 1989.- ¦ 11.- С.23-25.
14. Строев Е.А. Биологическая химия.- М.: Высш. школа, 1986.- 479 с.

It was conducted the investigation of immune parameters of blood and activities of metabolic enzymes of lymphocytes in healthy people and patients with virus hepatitis B (VHB). Humoral part of immunity was activated in these patients, but their cell immunity was not significantly changed. Besides that, lymphocytes' metabolism in patients was depressed (decreasing activities of enzymes which influence on the level of energetic and plastic processes).

Using computer neural networks-classifiers showed: patients with VHB are rather homogeneous by immune parameters and significantly differ from healthy people; patients with VHB are not homogeneous by levels of some enzymes activities. As patients groups gathered by neural networks has also some features of immune parameters, levels of enzymes activities are more important comparing with investigated immune parameters and they better reflect the level of lymphocytes activity.

Россиев Дмитрий Анатольевич, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Института медицинских проблем Севера СО РАМН, академический советник Международной академии информатизации. Родился в 1965 г. В 1988 г. закончил Красноярскую медицинскую академию, врач-терапевт по образованию. После окончания академии занимался научными исследованиями в области иммунологии и иммуногенетики. В 1993 г. защитил кандидатскую диссертацию. С 1993 г. руководил медицинской секцией научной группы "НейроКомп" (созданной на базе Красноярского вычислительного центра СО РАН), ведущей разработки в области компьютерных нейронных сетей. В 1996 г. защитил докторскую диссертацию "Самообучающиеся нейросетевые экспертные системы в медицине: теория, методология, инструментарий, внедрение". Автор нескольких нейросетевых экспертных систем для практической медицины. Имеет более 120 печатных работ, автор монографии "Нейронные сети на персональном компьютере" (совместно с проф. А.Н.Горбанем). Научные интересы - информатика, нейроинформатика, психология.

Савченко Андрей Анатольевич, доктор медицинских наук, заведующий лаборатории вирусологии Института медицинских проблем Севера СО РАМН. Родился в 1963 г. в г.Новокузнецке. В 1986 г. закончил Томский медицинский институт по специальности врач-биофизик. В том же году поступил в аспирантуру Института медицинских проблем Севера СО РАМН. В 1990 году защитил кандидатскую диссертацию. В 1996 году защитил докторскую диссертацию "Нарушение метаболического статуса лимфоцитов и иммуноэндокринного взаимодействия в патогенезе вторичных иммунодефицитов и гиперактивного состояния иммунной системы". Автор 95 научных публикаций и 2 изобретений. Научные интересы - иммунитет при вирусно-бактериальных инфекциях, аутоиммунные и аллергические заболевания.

Шакина Наталья Александровна окончила Красноярский государственный медицинский институт в 1983 году. После окончания клинической интернатуры работала врачом-биохимиком в клинико-диагностической лаборатории Института медицинских проблем Севера СО РАМН. В 1992 году окончила клиническую ординатуру по специальности "Клиническая лабораторная диагностика". С 1993 года работает в Краевом центре по профилактике и борьбе со СПИДом в должности заведующей отделения иммунологических исследований. Автор 8 научных публикаций. Научные интересы - иммунитет при вирусно-бактериальных инфекциях, аллергология.